“Data exchange” service offers individual users metadata transfer in several different formats. Citation formats are offered for transfers in texts as for the transfer into internet pages. Citation formats include permanent links that guarantee access to cited sources. For use are commonly structured metadata schemes : Dublin Core xml and ETUB-MS xml, local adaptation of international ETD-MS scheme intended for use in academic documents.
Export
Mićović, Tijana, 1990-
Farmakognozijska ispitivanja herbe izopa, Hyssopus officinalis L. (Lamiaceae) iz Crne Gore i Srbije
Autorstvo-Nekomercijalno 3.0 Srbija (CC BY-NC 3.0)
Academic metadata
Phd. theses
Medicinske nauke
doktor medicinskih nauka - farmacija
Univerzitet Crne Gore
Medicinski fakultet
Studijski program Medicina
Other Theses Metadata
Pharmacognostic investigation of aerial parts of Hyssopus officinalis L. (Lamiaceae) from Montenegro and Serbia
[T. Mićović]
PDF/A (150 pages)
Maksimović, Zoran (mentor)
Potpara, Zorica, 1963- (član komisije)
Stešević, Danijela, 1976- (član komisije)
Uvod
Izop (Hyssopus officinalis L., Lamiaceae) je aromatična i ljekovita biljka, čija se ljekovita svojstva koriste u tradicionalnoj medicini od davnina. Uprkos podacima o tradicionalnoj primjeni, još uvijek nema podataka o zvaničnoj primjeni herbe izopa u terapijske svrhe, što stvara potrebu za daljim, farmakognozijskim istraživanjima ove vrste. Pregledom dostupne literature, definisani su glavni ciljevi istraživanja u onim djelovima gdje nedostaje podataka ili su oskudni. Preliminarno je procijenjena opravdanost tradicionalne primjene i potencijalno novih mogućnosti za primjenu ispitivanih preparata herbe izopa, a sve u vezi sa njihovim hemijskim profilom.
Cilj
Glavni ciljevi disertacije su bili da se ispitaju antioksidativna, antimikrobna, genotoksična, antigenotoksična, citotoksična i antiinflamatorna svojstva hemijski okarakterisanih etarskih ulja i ekstrakata herbe izopa. Biljni materijal je sakupljen na pet različitih prirodnih lokaliteta u Crnoj Gori, a korišćen je i komercijalni uzorak, koji se sastojao od uzoraka sakupljenih na prirodnim staništima biljke sa juga Srbije.
Metodologija
Hemijski sastav je ispitan primjenom gasne hromatografije u kombinaciji sa masenom spektrometrijom (GC-MS), za etarska ulja, odnosno za ekstrakte - tečnom hromatografijom sa diodnim i masenim detektorom (eng. liquid chromatography with diode array and mass spectrometry, LC-DAD-MS). Antioksidativna aktivnost je ispitana primjenom testa neutralizacije DPPH radikala (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil radikal) i FRAP testa (eng. ferric reducing/antioxidant power test); za ispitivanje antimikrobne aktivnosti korišćena je mikrodiluciona i checkerboard metoda; genotoksična i antigenotoksična aktivnost je ispitana primjenom Komet testa; dok je citotoksičnost procijenjena MTT testom (3-(4,5-dimetiltiazol- 2-il)-2,5-difenil tetrazolijum bromid reagens), na tumorske ćelijske linije (SW480, MDA-MB
231, HeLa), kao i na zdravu, netransformisanu ćelijsku liniju humanih fibroblasta pluća (MRC-5). Antiinflamatorna svojstva preparata herbe izopa (etarskog ulja i metanolnih ekstrakata) su procijenjena in vivo, in vitro i in silico. Za in vitro ispitivanje etarskih ulja i ekstrakata herbe izopa, korišćeni su ciklooksigenaza-1 (COX-1) i ciklooksigenaza-2 (COX-2) enzimski testovi. In vivo antiinflamatorni potencijal ekstrakata (u dozama 50, 100 i 200 mg/kg) je procijenjen na modelu karagenanom izazvane inflamacije šape pacova. Molekularni doking je korišćen za in silico ispitivanje inhibitorne aktivnosti hlorogenske (eng. chlorogenic acid, CA) i rozmarinske kisjeline (eng. rosmarinic acid, RA), kao dominantnih jedinjenja u ispitivanim metanolnim ekstraktima, prema enzimaima COX-1 i COX-2.
Rezultati i diskusija
Rezultati su pokazali da su ispitivana etarska ulja herbe izopa bogata monoterpenskim ugljovodonicima (npr. limonen; 7.99%-23.81%), oksidovanim monoterpenskim jedinjenjima (1,8-cineol; 38.19%-67.1%) i fenilpropanoidima (metil eugenol; 0.00%-28.33%). Kvantitativno dominantna jedinjenja u ekstraktima su bila - rozmarinska (3.53-17.98 mg/g) i hlorogenska kisjelina (23.35-33.46 mg/g). Metanolni ekstrakti herbe izopa su pokazali slabu do srednje jaku antioksidativnu aktivnost (DPPH IC50 = 56.04-199.89 |ig/mL, FRAP = 0.667-0.959 mmol Fe2+/g). Pokazalo se da postoji određeni potencijal preparata herbe izopa da djeluju antimikrobno, posebno na gljivicu Candida albicans (nešto bolju aktivnost protiv C. albicans su pokazali ekstrakti). Preparati izopa su značajno redukovali oštećenja DNK u ćelijama pune krvi, koja su prethodno izazvana vodonik peroksidom. Metanolni ekstrakti su pokazali selektivnu, i moćnu, dozno i vremenski zavisnu, aktivnost protiv HeLa tumorske ćelijske linije. Značajna inhibitorna aktivnost je pokazana u COX-2 testu i to kada su u pitanju ekstrakti. Naime, svi analizirani ekstrakti, pri koncentraciji 20 |ig/ml su dali procenat inhibicije COX-2 enzima (54.04 - 63.04%) koji se nije stratistički značajno razlikovao od pozitivne kontrole, celekoksiba (61.60%), pri koncentraciji 8.8 |iM. U in vivo ispitivanju svi metanolni ekstrakti herbe izopa, u najvišoj ispitivanoj dozi od 200 mg/kg u trećem i četvrtom satu, nakon primjene karagenana, su pokazali statistički značajan (p < 0.05) inhibitorni efekat na povećanje edema šape pacova u odnosu na kontrolu. Ova aktivnost je uporediva ili veća u odnosu na referentnu supstancu, indometacin pri koncentraciji 8 mg/kg. Preliminarni in silico rezultati sugerišu da ispitivana jedinjenja (RA i CA) pokazuju bolju inhibitornu aktivnost prema COX-1 i COX-2 od standardnog nesteroidnog antiinflamatornog lijeka (NSAIL), ibuprofena, što se vidi iz slobodne energije vezivanja (AGbind u kJ mol-1). Naime, vezivna energija ispitivanih jedinjenja prema COX-1 i COX-2 je bila u opsegu od -48.2 do -50.8 kJ mol-1. Ibuprofen, kao NSAIL, za ista receptorska ciljna mjesta, je pokazao značajno višu energiju vezivanja (AGbind=-31.3 kJ mol-1 za COX-1 i AGbind=-30.9 kJ mol-1 za COX-2).
Zaključak
Definisana su dominantna jedinjenja, kao potencijalni markeri kvaliteta biljne droge Hyssopi herba. Dobijeni rezultati, demonstriraju značajan ljekoviti potencijal H. officinalis, opravdavaju primjenu u tradicionalnoj medicini, otvaraju nova vrata i pozivaju na dodatna in vivo istraživanja naročito ekstrakata herbe izopa, kako bi se istražili molekularni mehanizmi
antigenotoksične, citotoksične (prema HeLa ćelijskoj liniji) i antiinflamatorne aktivnosti u živim sistemima i kako bi se u budućnosti možda razvio neki novi lijek ili suplement.
Introduction
Hyssop (Hyssopus officinalis L., Lamiaceae) is a medicinal and aromatic plant, whose medicinal properties have been used in traditional medicine since ancient times. Despite the data on traditional use, there is still no data on the official use of hyssop herb for therapeutic purposes, which creates the need for further, pharmacognosy research of this species. A review of the available literature has defined the main objectives of the research in those parts where data are lacking or scarce. The justification of the traditional application and potentially new possibilities for the application of the tested hyssop herb preparations were preliminary assessed, all in connection with their chemical profile.
Aim of the study
The main aims of this study were to assess the antioxidant, antimicrobial, genotoxic, antigenotoxic, cytotoxic and anti-inflammatory properties of characterized hyssop essential oils and methanol extracts. Plant material was collected from five localities in the territory of Montenegro. In addition a commercial sample was used, which consisted of samples collected at natural localities from southern Serbia.
Methodology
Chemical composition of essential oils and extracts was analyzed by gas chromatography - mass spectrometry (GC-MS) and liquid chromatography with diode array detection and mass spectrometry (LC-DAD-MS), respectively. Antioxidant activity was examined by 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) and ferric reducing/antioxidant power (FRAP) tests; microdilution and checkerboard methods were used to test antimicrobial activity; genotoxic and antigenotoxic activity were examined by the comet assay, while cytotoxicity was evaluated by the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyltetrazolium bromide dye (MTT) test against tumor cell lines (SW480, MDA-MB 231, HeLa) and non- transformed human lung fibroblast cell lines (MRC-5). Anti-inflammatory potential of
hyssop herb preparations (essential oil and methanol extracts) was evaluated in vivo, in vitro and in silico. For in vitro testing of essential oils and extracts of hyssop herb, the cyclooxygenase-1 (COX-1) and cyclooxygenase-2 (COX-2) enzyme assays were used. In vivo anti-inflammatory potential of the extracts (at doses of 50, 100 and 200 mg/kg) was assessed using the carrageenan-induced rat paw edema test. Molecular docking was used for in silico testing of the inhibitory activity of chlorogenic (CA) and rosmarinic (RA) acids, as the dominant compounds in the tested methanol extracts against COX-1 and COX-2 enzymes.
Results and discussion
The essential oils were rich in monoterpene hydrocarbons (e.g., limonene; 7.99%- 23.81%), oxygenated monoterpenes (1,8-cineole; 38.19%-67.1%) and phenylpropanoids (methyl eugenol; 0.00%-28.33%). In methanol extracts, the most abundant phenolics were chlorogenic and rosmarinic acid (23.35-33.46 and 3.53-17.98 mg/g, respectively). Methanol extracts expressed moderate to weak antioxidant activity (DPPH IC50 = 56.04-199.89 gg/mL, FRAP = 0.667-0.959 mmol Fe2+/g). It has been shown that there is a certain antimicrobial potential of hyssop herb preparations, especially on the Candida albicans species (and slightly better activity against C. albicans was shown for extracts). Hyssop preparations significantly reduced DNA damage in human whole blood cells, induced by pretreatment with hydrogen peroxide. Methanol extracts exhibited selective and potent dose- and time-dependent activity against the HeLa cell line. Significant inhibitory activity was shown in the COX-2 test regarding extracts (essential oils did not exhibit any significant activity). Namely, all analysed extracts, at a concentration of 20 gg/ml, showed a percentage of inhibition of COX-2 enzyme (54.04 - 63.04%), which did not indicate a statistically significant difference from the positive control of celecoxib (61.60%) at a concentration of 8.8 gM. In vivo testing showed that all methanol extracts of hyssop herb, at the highest test dose of 200 mg/kg in the third and fourth hours, after carrageenan administration, exhibited a statistically significant (p < 0.05) inhibitory effect on the increase in rat paw edema in relation to control. This activity is comparable or higher in relation to the reference substance, indomethacin, at a concentration of 8 mg/kg. The preliminary in silico results suggest that investigated compounds (RA i CA) show better inhibitory activity against COX-1 and COX- 2 than standard non-steroidal anti-inflammatory drug (NSAID), ibuprofen, as evident from the free binding energy (AGbind in kJ mol-1). The binding energies of the docked compounds to COX 1 and 2 were found to be in the range between -48.2 and -50.8 kJ mol-1. Ibuprofen, as the one NSAID, for the same receptors targets, showed remarkably higher binding energy (AGbind=-31.3 kJ mol-1 to COX-1, and AGbind=-30.9 kJ mol-1 to COX-2).
Conclusion
Dominant compounds have been defined as potential markers of the quality of the herbal drug Hyssopi herba. The obtained results demonstrate the significant healing potential of H. officinalis, justify the use in traditional medicine, open the door to and the need for further in vivo testing of extracts in order to further examine the molecular mechanism of antigenotoxic, cytotoxic (against HeLa cell line) and anti-inflammatory activity in living systems and possibly develop a new anti-inflammatory drug or supplement.
Hyssopus officinalis; antioksidativna aktivnost; antigenotoksična aktivnost; Komet test; citotoksična aktivnost; HeLa ćelijska linija; GC-MS; LC-DAD-MS; antiinflamatorna aktivnost; in silico studije
Hyssopus officinalis; antioxidant activity; antigenotoxic activity; Comet assay; cytotoxic activity; HeLa cell line; GC-MS; LC-DAD-MS; anti-inflammatory activity; in silico studies.
615.322.07:543.2[582.929.2(497.16)(043.3)
Serbian
25094916
Tekst.
Uvod
Izop (Hyssopus officinalis L., Lamiaceae) je aromatična i ljekovita biljka, čija se ljekovita svojstva koriste u tradicionalnoj medicini od davnina. Uprkos podacima o tradicionalnoj primjeni, još uvijek nema podataka o zvaničnoj primjeni herbe izopa u terapijske svrhe, što stvara potrebu za daljim, farmakognozijskim istraživanjima ove vrste. Pregledom dostupne literature, definisani su glavni ciljevi istraživanja u onim djelovima gdje nedostaje podataka ili su oskudni. Preliminarno je procijenjena opravdanost tradicionalne primjene i potencijalno novih mogućnosti za primjenu ispitivanih preparata herbe izopa, a sve u vezi sa njihovim hemijskim profilom.
Cilj
Glavni ciljevi disertacije su bili da se ispitaju antioksidativna, antimikrobna, genotoksična, antigenotoksična, citotoksična i antiinflamatorna svojstva hemijski okarakterisanih etarskih ulja i ekstrakata herbe izopa. Biljni materijal je sakupljen na pet različitih prirodnih lokaliteta u Crnoj Gori, a korišćen je i komercijalni uzorak, koji se sastojao od uzoraka sakupljenih na prirodnim staništima biljke sa juga Srbije.
Metodologija
Hemijski sastav je ispitan primjenom gasne hromatografije u kombinaciji sa masenom spektrometrijom (GC-MS), za etarska ulja, odnosno za ekstrakte - tečnom hromatografijom sa diodnim i masenim detektorom (eng. liquid chromatography with diode array and mass spectrometry, LC-DAD-MS). Antioksidativna aktivnost je ispitana primjenom testa neutralizacije DPPH radikala (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil radikal) i FRAP testa (eng. ferric reducing/antioxidant power test); za ispitivanje antimikrobne aktivnosti korišćena je mikrodiluciona i checkerboard metoda; genotoksična i antigenotoksična aktivnost je ispitana primjenom Komet testa; dok je citotoksičnost procijenjena MTT testom (3-(4,5-dimetiltiazol- 2-il)-2,5-difenil tetrazolijum bromid reagens), na tumorske ćelijske linije (SW480, MDA-MB
231, HeLa), kao i na zdravu, netransformisanu ćelijsku liniju humanih fibroblasta pluća (MRC-5). Antiinflamatorna svojstva preparata herbe izopa (etarskog ulja i metanolnih ekstrakata) su procijenjena in vivo, in vitro i in silico. Za in vitro ispitivanje etarskih ulja i ekstrakata herbe izopa, korišćeni su ciklooksigenaza-1 (COX-1) i ciklooksigenaza-2 (COX-2) enzimski testovi. In vivo antiinflamatorni potencijal ekstrakata (u dozama 50, 100 i 200 mg/kg) je procijenjen na modelu karagenanom izazvane inflamacije šape pacova. Molekularni doking je korišćen za in silico ispitivanje inhibitorne aktivnosti hlorogenske (eng. chlorogenic acid, CA) i rozmarinske kisjeline (eng. rosmarinic acid, RA), kao dominantnih jedinjenja u ispitivanim metanolnim ekstraktima, prema enzimaima COX-1 i COX-2.
Rezultati i diskusija
Rezultati su pokazali da su ispitivana etarska ulja herbe izopa bogata monoterpenskim ugljovodonicima (npr. limonen; 7.99%-23.81%), oksidovanim monoterpenskim jedinjenjima (1,8-cineol; 38.19%-67.1%) i fenilpropanoidima (metil eugenol; 0.00%-28.33%). Kvantitativno dominantna jedinjenja u ekstraktima su bila - rozmarinska (3.53-17.98 mg/g) i hlorogenska kisjelina (23.35-33.46 mg/g). Metanolni ekstrakti herbe izopa su pokazali slabu do srednje jaku antioksidativnu aktivnost (DPPH IC50 = 56.04-199.89 |ig/mL, FRAP = 0.667-0.959 mmol Fe2+/g). Pokazalo se da postoji određeni potencijal preparata herbe izopa da djeluju antimikrobno, posebno na gljivicu Candida albicans (nešto bolju aktivnost protiv C. albicans su pokazali ekstrakti). Preparati izopa su značajno redukovali oštećenja DNK u ćelijama pune krvi, koja su prethodno izazvana vodonik peroksidom. Metanolni ekstrakti su pokazali selektivnu, i moćnu, dozno i vremenski zavisnu, aktivnost protiv HeLa tumorske ćelijske linije. Značajna inhibitorna aktivnost je pokazana u COX-2 testu i to kada su u pitanju ekstrakti. Naime, svi analizirani ekstrakti, pri koncentraciji 20 |ig/ml su dali procenat inhibicije COX-2 enzima (54.04 - 63.04%) koji se nije stratistički značajno razlikovao od pozitivne kontrole, celekoksiba (61.60%), pri koncentraciji 8.8 |iM. U in vivo ispitivanju svi metanolni ekstrakti herbe izopa, u najvišoj ispitivanoj dozi od 200 mg/kg u trećem i četvrtom satu, nakon primjene karagenana, su pokazali statistički značajan (p < 0.05) inhibitorni efekat na povećanje edema šape pacova u odnosu na kontrolu. Ova aktivnost je uporediva ili veća u odnosu na referentnu supstancu, indometacin pri koncentraciji 8 mg/kg. Preliminarni in silico rezultati sugerišu da ispitivana jedinjenja (RA i CA) pokazuju bolju inhibitornu aktivnost prema COX-1 i COX-2 od standardnog nesteroidnog antiinflamatornog lijeka (NSAIL), ibuprofena, što se vidi iz slobodne energije vezivanja (AGbind u kJ mol-1). Naime, vezivna energija ispitivanih jedinjenja prema COX-1 i COX-2 je bila u opsegu od -48.2 do -50.8 kJ mol-1. Ibuprofen, kao NSAIL, za ista receptorska ciljna mjesta, je pokazao značajno višu energiju vezivanja (AGbind=-31.3 kJ mol-1 za COX-1 i AGbind=-30.9 kJ mol-1 za COX-2).
Zaključak
Definisana su dominantna jedinjenja, kao potencijalni markeri kvaliteta biljne droge Hyssopi herba. Dobijeni rezultati, demonstriraju značajan ljekoviti potencijal H. officinalis, opravdavaju primjenu u tradicionalnoj medicini, otvaraju nova vrata i pozivaju na dodatna in vivo istraživanja naročito ekstrakata herbe izopa, kako bi se istražili molekularni mehanizmi
antigenotoksične, citotoksične (prema HeLa ćelijskoj liniji) i antiinflamatorne aktivnosti u živim sistemima i kako bi se u budućnosti možda razvio neki novi lijek ili suplement.